жизнь имеет значение
(495­) 517­ 62 ­82
с 10:30 до 19:00
Трансфер-Фактор в онкологии

Цитотоксический тест, российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН

Киселевский М.В., Халтурина Е.О., Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН

Ход исследования: Исследование проводилось на лимфоцитах здоровых доноров. Кровь получена из донорского пункта РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли по стандартной методике в градиенте плотности фикола-урографина ρ=1,077 г/см3. Полученные мононуклеарные клетки вносили в лунки 96-луночного микропланшета (“Costar”) в количестве 60 тыс. клеток на одну лунку в 100 мкл культуральной среды. Затем в лунки добавляли тестируемые вещества (I, A, B, G, J), при этом конечные концентрации этих веществ составили 1мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,01 мг/мл, 0,001 мг/мл, 0,0001 мг/мл 0,00001 мг/мл. Инкубацию в условиях СО2-инкубатора в атмосфере 5% СО2, 100% влажности и при температуре 370С проводили в течение 24 и 48 часов. По окончании инкубации в лунки вносили опухолевые клетки линии К-562 (эритробластный лейкоз человека) в количестве 30 тыс. клеток на лунку. Таким образом, соотношение клеток-эффекторов и клеток-мишеней составило 2:1. Варианты исследования тестированы в триплетах.

Цитотоксический тест

МТТ-метод определения жизнеспособности клеточных культур заключается в способности живых клеток превращать растворимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) в нерастворимые пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана (МТТ-ф). Нежизнеспособные мертвые клетки такой способностью не обладают. Интенсивность превращения МТТ в МТТ-ф отражает общий уровень дегидрогеназной активности исследуемых клеток и модулируется активностью сопряженных ферментных систем, например, дыхательной цепи переноса электронов и т.д.

Раствор МТТ приготовлен в концентрации 5 мг/мл на основе солевого раствора Хенкса.

После окончания совместной инкубации клеток-эффекторов и клеток-мишеней (через 18-24 час. в атмосфере 5% СО2 , 100% влажности и при температуре 370С) во все лунки планшета было добавлено по 20 мкл рабочего раствора МТТ. После 3-4 часовой инкубации в СО2-инкубаторе (условия те же) планшеты центрифугированы при 1500 об/мин в течение 5 минут, удалили супернатант и в каждую лунку добавили по 150 мкл ДМСО (диметилсульоксид, “Serva”). Через 30 минут инкубации при комнатной температуре, после полного растворения кристаллов формазана измерена оптическая плотность содержимого лунок на мульти-луночном спектрофотометре (“MultiScan MCC 340”, Labsystems) при длине волны 540 нм. Цитотоксичность выражена цитотоксическим индексом (ЦИ) в процентах.

Расчет ЦИ проводился по стандартной формуле:

ЦИ (%)= [1-(ОПэ+м-ОПэ)/ОПм]*100

Где: ОПэ+м - значение оптической плотности в опытных сериях;

ОПэ - значение оптической плотности в лунках с эффекторами;

ОПм - значение оптической плотности в лунках с мишенями.

Результаты:

Таблица №1

Цитотоксический индекс (%)

 

1 мг/мл

0,1 мг/мл

0,01 мг/мл

0,001 мг/мл

0,0001 мг/мл

0,00001 г/мл

24 ч.

48 ч.

24 ч.

48 ч.

24 ч.

48 ч.

24 ч.

48 ч.

24 ч.

48 ч.

24 ч.

48 ч.

I

35

19.3

17

50

29

54.7

18

15.3

18

40.7

15

11.3

A

13.5

23.3

20.3

12

35

17

28.5

42

10

48

20.3

62

B

13.3

48

10.6

82.7

29

96.7

30

69.4

21.6

54

76

91

G

80

97

47

94

24

99

12

90

30

96

26.3

91

J

16

68

37

49

47

45

47

35

16.1

58

34.3

70

Как следует из данных, представленных в таблице №1, все тестируемые вещества обладают стимулирующим действием на противоопухолевую и цитотоксическую активность лимфоцитов здоровых доноров при испытании на НК-чувствительной линии опухолевых клеток К-562.

Наибольший стимулирующий эффект отмечается через 48 часов. Наиболее эффективный диапазон воздействующих концентраций от 0,1 до 0,0001 мг/мл. Наиболее эффективными в данных условиях эксперимента оказались тестируемые вещества В и G, которые через 48 часов инкубации значительно повысили киллерную активность мононуклеарных клеток, что привело к лизису 80-99% опухолевых клеток.

В контрольной серии экспериментов прямого цитотоксического действия на опухолевые клетки в исследуемом диапазоне концентраций для тестируемых веществ не обнаружено.

Спонтанная цитотоксическая активность не стимулированных мононуклеаров составила 18±6%.

Заключение:

Таким образом, тестируемые вещества обладают стимулирующим действием на противоопухолевую и цитотоксическую активность мононуклеарных клеток крови здоровых доноров, при этом наибольший эффект наблюдается через 48 часов инкубации мононуклеаров с различными концентрациями тестируемых веществ. Оптимальным уровнем воздействующих концентраций следует считать от 0,1 до 0,0001 мг/мл. Среди тестируемых веществ наибольшим стимулирующим действием обладают соединения В и G, инкубация с которыми приводит к увеличению цитотоксичности мононуклеарных клеток в среднем с 18±6% до 80-99%.

Замечательные результаты!
Следует продолжить для набора фактов.
подпись /Воробьев А.А./

 

© 2011-2017, Zhulev Sergey
+7 (495­) 517­ 62 ­82
Яндекс.Метрика